Unterabschnitte
Restriktion und Reparatur
Neben den Mechanismen für das Umschreiben der DNA gibt es eine
Vielzahl von Enzymen, die die DNA modifizieren oder reparieren.
Bei Bakterien finden sich sogenannte Restriktionsendonukleasen, die an
einer bestimmten Stelle die DNA zerschneiden, wenn diese nicht
methyliert ist. Dieser Mechanismus führt dazu, dass alle DNA
(Plasmid-, Phagen- und Bakterien-DNA), die das Bakterium durchlaufen
hat, ein charakteristisches, vor den Enzymen schützende
Methylierungsstruktur aufweist.
Man kann die Restriktionsendonukleasen in zwei Klassen
unterteilen. Bei den Enzymen von Typ-I und Typ-III handelt es sich um
eine Enzym, das für Modifikation der DNA und die Restriktion
verantwortlich ist, während bei Typ-II, einem Enzym aus zwei
Untereinheiten ein Enzym für Methylierung und Restriktion
verantwortlich ist.
Die klassischen Restriktionsenzyme gehören zum Typ-II.
In wenigen Fällen findet man auch Restriktionsendonukleasen, die
gezielt eine bestimmte Sequenz abbauen, wenn diese methyliert ist.
Bei dem bekannten EcoRI besteht das Enzym aus zwei Untereinheiten, die
als Dimer aktiv werden. Wie für die meisten Restriktionsenzyme ist
auch die Schnittstelle für EcoRI ein Palindrom. Nur eine vollständig
methylierte DNA wird erkannt, eine hemimethylierte wird nicht
geschnitten, sondern von einer Methylase methyliert.
Die Schnittaktivität des TypII wird immer innerhalb der Sequenz oder
knapp daneben ausgeführt. Die Methylierung erfolgt immer nur an einer
Base, danach dissoziiert das Enzym ab.
Die Multimere von TypI und TypIII üben Methylierung und Restriktion
parallel aus.
Die TypI-Enzyme bestehen aus einer Einheit zum Erkennen der DNA und je
zwei Einheiten zum Methylieren und Schneiden, wobei die beiden
Aktivitäten ausschliessen. Die Aktivität des Enzyms wird dadurch
gesteuert, ob die Zielsequenz methyliert ist oder nicht. Normalerweise
befindet sich bei diesem Typ die Spaltstelle mehr als 1000 bp von der
Erkennungssequenz entfernt.
Die Aktivität entsprechende dem TypIII findet man nur sehr selten. Die
Enzyme bestehen aus zwei Arten von Untereinheiten. Die eine ist für
die Restriktion, die andere für die Methylierung und das Erkennen der
DNA verantwortlich. Nach der Bindung treten Restriktion und
Methylierung gleichzeitig auf, d.h. die konkurrieren um die
DNA. Die Restriktion erfolgt in einem Abstand von ca. 24 Basen, die
Methylierung direkt an der Erkennungsdequenz. Die von diesem Typ
methyliertern Stellen wrden nur an einem Strang methyliert. nach der
Replikation erfolgt eine Methylierung, da das Enzym bei einer
einzelnen unmethylierten Stelle diese metyhliert und nur wenn beide
Seiten nicht methyliert sind, die Stelle schneidet.
Schäden an der DNA können in unterschiedlicher Form auftreten:
Bei einem Einzelbasentausch ist eine einzelne Base vertauscht. Dies
hat eine Auswirkung auf die Sequenz, nicht aber auf das Leseraster.
Die strukturelle Verzerrung, hervorgerufen durch kovalente Bindungen
zwischen benachbarten oder genüberliegenden Basen kann die Replikation
und die Transkription behindern.
Auch die Reparatur lässt sich in mehrere Systeme einteilen: Die direkte
Reaparatur ist selten und entfernt einen Schaden einfach (z.B. bei
UV-Schäden der Fall). Bei der Excisionsreaparatur wird ein mangehafter
Abschnitt erkannt, ausgeschnitten und das fehlende Material neu
synthetisiert. Die Fehlpaarungskorrektur kann während der Replikation
den alten von dem neuen Strang unterscheiden und korrigiert bevorzugt
die Basen des neuen Strangs. Die Toleranzsysteme greifen ein, wenn die
Replikation an einer Stelle stecken bleibt, indem sie die geschädigte
Sequenz kopieren.
Die Wiederherstellungssysteme ähneln den Toleranzsystemen. Sie führen
eine Reparatur durch Replikation des nicht modifizierten Strangs
durch.
Das Excisionsreparatursysteme wirken in mehreren Schritten: Im
Einschneideschritt erkennt eine Endonuklease die geschädigte Struktur
und spaltet die DNA. Im Ausschneideschritt wird das beschädigte Stück
von 5' nach 3' entfernt und im Synthseschritt füllt die DNA-Polymerase
die Lücke.
Neben der konstitutiv stattfindenden Reaparatur kurzer Stücke findet
durch eine massive Schädigung induziert auch die Reparatur langer
Stücke statt. Diese scheint der normalen Replikation sehr ähnlich zu
sein.
Eine Besonderheit ist die fehleranfällige DNA-Synthese, bei der es ein
Toleranzweg der Replikation erlaubt bei einem Fehlen der
komplementären Basen willkürliche Basen einzufügen.
Bei zwei unpassend gepaarten Basen kann das Reparatursystem nicht von
sich aus entscheiden, welche der beiden die richtige ist.
Bei einer Desaminierung von Methy-Cytosin zu Thymin gibt es ein
spezielles Reparaturenzym, das diese Modifikation umkehrt. Ein anderes
System ersetzt das A in AC und AG. Ausserdem lässt sich bei Fehlern, die
während der Replikation auftreten, der Elternstrang an Hand der
Methylierung identifizieren und der Tochterstrang wird selektiv
korrigiert.
Die wiederherstellungssysteme arbeiten dann wenn die Replikation durch
strukturelle Veränderungen verändert wird. Wenn z.B, zwei Basen
kovalent verbunden sind, entsteht eine Lücke in einem der
Einzelstränge gegenüber der modifizierten Basen. Diese Lücke wird von
den Widerherstellungssystemen geschlossen, indem ein
Einzelstrangtausch durchgeführt wird. Dabei wird der entsprechende
Einzelstrang des anderen, korrekt replizierten Tocherstrangs auf den
beschädigten Übertragen und die dadurch enstehende Lücke
geschlossen. Dieses System wird von RecA und verwandten Proteinen
vermittelt.
Neben der Beteiligung an der Rekombinationsreparatur hat das Protein
noch weitere Funktionen, die durch eine Schädigung der DNA aktiviert
werden. Die darauf folgende Antwort wird als SOS-Antwort bezeichnet
und ist durch die Expression vieler Gene mit Reparaturfunktion
gekennzeichnet.
Diese Antwort beginnt mit der Aktivierung von RecA. Das zu dieser
Aktivierung führende Signal ist unbekannt, hat aber innerhalb weniger
Minuten die RecA-vermittelte SOS-Antwort zur Folge. Die Aktivierung
von RecA führt zu einer proteolytischen Spaltung von LexA, das an
vielen Operons als Repressor dient und nach der Spaltung eine
Proteaseaktivität entwickelt, die zu einer autokatalytischen Spaltung
führt und so alle Operatoren von LexA befreit. Die so aktivierten
Zielgene haben alle Reparaturfunktionen.
Durch eine positive Rückkopplung von LexA auf recA wird
sichergestellt, dass LexA die Gene nicht mehr reprimieren kann. Wenn
RecA seine Fähigkeit, LexA zu stabilisieren verliert, kehrt die Zelle
sehr schnell wieder auf ds Ausgangsniveau der Expression zurück.
In Eukaryontenzellen ist die Reparatur häufig an die Transkription
gekoppelt, indem aktiv transkribierte Gene bevorzugt repariert
werden. Die genauen Mechanismen sind noch zu grossen Teilen
unverstanden.
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