Die Replikation

Für die Replikation der DNA bei E. coli sind insgesamt drei unterschiedliche Polymerasen, mit Polymerase I bis III bezeichnet, verantwortlich. Alle bakteriellen Enzyme weisen eine 3'-5'-Exonuklease, die entgegen der Reichtung, in der die Polymerase arbeitet ein Korrekturlesen (proof-reading) vornimmt und falsche Basen entfernt, auf. Bei einer falschen Basenpaarung bewegt sich die Polymerase wieder ein Stück zurück und löst die falsch gepaarte Base ab.

Die Polymerase I hat die Fähigkeit, die Replikatin in vitro an einem Einzelstrangbruch zu beginnen. Während an dem Bruch (nick) neue DNA synthetisiert wird, kann dadurch die alteDNA verdrängt werden. Dieser Prozess wird Nicktranslation genannt. Sie dient in vivo wohl vor allem dem Auffüllen von kurzen einzelsträngigen Bereichen.

Die eigentliche Replikation wird von der Polymerase III durchgeführt. Die Fehler, die die Polymerase machen kann, können entweder in dem Einbau des falschen Nukleotids liegen oder es kommt durch den Einbau von einem zusätzlichen, bzw. dem Auslassen von einem Nukleotid zu einer Verschiebung des Leserasters. Die beiden Fehlertypen werden unterschiedlich korrigiert:

Die Wahrscheinlichkeit einer Leserrasterverschiebung wird durch die Prozessivität der Polymerase beeinflusst. Unter Prozessivität versteht man die Tendenz des Proteins auf einer einzelnen Matrize zu verbleiben, statt sich zu lösen. Je höher die Prozessivität desto geringer das Auftreten von Leserasterverschiebungen.

Die Korrektur von falschen Basen erfolgt durch die Exonuklease-Aktivität.

Bei Eukaryonten findet man zwei DNA-Polymerasen, die Polymerase $\alpha$ und die Polymerase $\delta$ . Die DNA-Polymerase $\alpha$ initiiert die Bildung des Strangs, während $\delta$ den Strang verlängert. (Folgestrang, Leistrang ???)

Die DNA-Polymerase ist immer auf einen Primer zur Initiierung der Replikation angewiesen. Dieser kann aus einerm Stück RNA bestehen, er kann ein Stück DNA (z.B. nach einem Einzelstrangbruch) sein oder von einem Protein, das ein Nukleotid gebunden hat, gebildet werden.

Man unterscheidet bei der Replikation einen Leitstrang, der kontinuierlich von 5' nach 3' synthetisiert wird und einen Folgestrang, der Stückweise ebenfalls von 5' nach 3' gebildet wird.

Im Folgestrang werden Okazaki-Fragmente mit einer Länge von 1000 bis 2000 bp synthetisiert, die dann kovalent miteinander Verbunden werden. Sowohl bei Eukaryonten, wie auch bei E. coli findet man die semidiskontinuierliche Replikation. Die Primer zum Beginn der Polymeraseaktivität bzw. der -aktivitäten auf dem Folgestrang besteht aus RNA. Der Primer wird nach der Replikation entfernt und durch die Polymerase I aufgefüllt und durch die DNA-Ligase verbunden.

Die Bildung der Replikationsgabel bedarf zunächst zweiter Proteine, der Helikase, die die DNA-Stränge trennt und der einzelstrangbindenden Proteine, die eine Zusammenlagerung der gertrennten Einzelstränge verhindern. Die Bindung dieser Moleküle erfolgt kooperativ und bedeckt so die gesamte einzelstängige DNA.

Bei E. coli initiiert der Aufbau eines Primosoms an der Primosomenaufbaustelle die Replikation. Das Primosom bewegt sich von einer Bindungsstelle für die Primer der Okazaki-Fragmente zur nächsten.

Das Anbringen der Primer ist Aufgabe der Primase. Dabei handelt es sich um eine RNA-Polymerase, die ein kurzes RNA-Stück als Primer synthetisiert.

Bei E. coli hat man Terminationssequenzen von 23 bp länge gefunden, die die Replikation in einer Richtung aufhalten, allerdings sehr wahrscheinlich durch eine aus der anderen Richtung kommende Polymerase verdrängt werden können.

Die Koordination der Replikation von Leit- und Folgestrang wird auf unterschiedliche Arten gewährleistet:

Man nimmt an, dass die beiden Polymerasen der Prokaryonten für den Leit- und Folgestrang ein Holoenzym bilden, das der Helikase folgt. Während die Polymerase des Leistrangs diesem kontinuierlich folgt, bildet der Folgestrang durch die Aktivität der anderen Polymerase eine Schleife aus, in der bereits der Primer aufgebracht wird, so dass die andere Polymerase, sobald sie sich von dem Folgestrang löst, sofort mit der Synthese des nächsten Framentes beginnen kann.

Bei den Eukaryonten liegen zwei Polymerasen, die Polymerase $\alpha$ und die Polymerase $\delta$ vor. Früher dachte man, dass die Polymerase $\alpha$ den Folgrstrang und die Polymerase $\delta$ den Leitstrang synthetisiert; nun scheint es aber so, dass die Polymerase $\alpha$ für die Inititation der Replikation verantwortlich ist, indem sie den RNA-Primer um ein kurzes Stück DNA verlängert, an dem dann die Polymerase $\delta$ angreifen kann. Es scheint als wäre die Polymerase $\delta$ für die Elongation beider Stränge verantwortlich.

Die DNA des Phagen unterscheidet sich von der DNA der Zelle dadurch, dass der Phage Hydorxymethylcytosin an der Stelle von Cytosin verwendet und so seine DNA von der des Wirts unterscheiden kann. Die Replikation des Phagen wird von einem Multienzymkomplex katalysiert. Die Replikationsmaschinerie gleicht vom Aufbau der des Wirtes, nur wird nicht dessen Maschinerie benutzt, da die so hergestellte DNA zu schnell abgebaut würde.

Es scheint so, dass allen Systemen die Probleme der REplikation gemein sind und sie auf ähnliche Art und Weise gelöst werden:

Die Helikase öffnet die DNA
Die Primase bringt einen Primer an
Einzelstranbindende Proteine stabilisieren die Einzelstränge
Eine gleitende Klammer hält den Komplex an der DNA
Diese Klammer wird durch eine ATPase beladen
Die eigentliche Katalyse muss durchgeführt werden
In vielen Fällen dimerisieren die Untereinheiten der Polymerase
Die Primer-RNA muss entfernt werden
Die Ligation wird von einer Ligase geschlossen.
In vielen Fällen verhindert eine Topoisomerase eine Überspiralisierung

Entstehung der Replikatinsgabel

Bei der Entstehung der Replikationsgabel bei E. coli sind sechs Proteine beteiligt: DnaA, DnaB, DnaC, HU, Gyrase und SSB.

DnaA ist nur an der Initiation beteiligt und bindet als erstes Protein an die oriC-Sequenz. Dann schmilzt es die DNA an mehreren auf den oriC folgenden Stellen auf und sorgt dafür, dass diese einen offenen Komplex bilden.

DnaB und DnaC bilden den Motor der Initiation, vergleichbar dem Primosom. Ausserdem weist der Komplex aus diesen Proteinen Helikase-Ativität auf. Dieser Komplex bindet an die durch DnaA erzeugte Einzelstrangstruktur. Die Helikasereaktion ist ATP-abhängig.

Die Gyrase dient als Drehgelenk und verhindert eine Überspiralisierung. Die SSB stabilisieren die Einzelstränge und das Protein HU ist eine DNA-bindendes Protein, das die DNA verbiegen kann und sehr wahrscheinlich der Strukturbildung dient.

Nachdem die sich die Replikationsgabel gebildet hat, findet die erste Primingreaktion statt. Das Priming wird durch das Aufschmelzen der DNA eingeleitet.

In Bakterien hängt die Initation der Replikation von der Methylierung des oriC ab. Im Normalzustand ist die DNA methyliert. Wenn nun die Replikation statt gefunden hat liegt die DNA in einer hemimethylierten Form vor, in der sie nicht weiter repliziert wird. Die Sequenz wird erst nach ungewöhnlich langen Zeit von 13 Minuten wieder methyliert. Diese Verzögerung wird von einem speziellen Protein SeqA induziert, indem es stark an die hemimetyhlierte DNA bindet und diese so für die Methylierung blockiert.

Eine weitere Eigenschaft der hemimethylierten DNA ist eine gute Bindung an die Zellmembran. Dies könnte eine Reinitiation der Replikation verhindern. Die Anheftung an die Membran könnte eine Funktion von DnaA sein.

In einer Eukaryontenzelle muss gewährleistet sein, dass die Replikation an jedem Replicon nur einmal stattfindet. Man vermutet, dass sich im Zellkern ein sogenannter Lizenzfaktor befindet, der während der Replikation aufgebraucht wird und nur dadurch, dass in der Mitose neuer Faktor aus dem Cytoplasma in den Zellkern gelangt wieder reaktiviert werden kann. Ein potentieller Kandidat für diesen Mechanismus wären die MCM2, 3 und 5-Proteine, die man in der Hefe nachweisen konnte.

Das Replicon Inhalt Replikation der DNA Restriktion und Reparatur