Proteinfraktionierung
Um die einzelnen Proteine eines Organells zu isolieren verwendet man
in der Regel chromatografische Methoden.
Bei der Säulenchromatografie wird eine Lösung mit Proteinen über eine
Säule mit einer porösen, festen Matrix geschickt. Durch Interaktion
der Proteine mit der Matrix werden die Proteine unterschiedlich
zurückgehalten und gemäss ihrer Grösse, Ladung, Hydrophobie oder
Bindungseigenschaften aufgetrennt.
Bei der Affinitätschromatografie
wird ein Enzymgemisch nach seiner Wechselwirkung zu einem Substrat
aufgetrennt. Dabei ist das Substrat an die Säule gebunden und man lässt
das Gemisch darüber laufen. Auf ähnliche Weise kann mit komplenemtärer
DNA auch nach DNA-Fragmenten suchen.
Bei der HPLC, der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie wird eine
sehr gute Auflösung erreicht, indem an Steller einer Matrix ein
homogenes Säulenbett verwendet wird. Durch dieses Säulenbett wird das
zu trennende Gemisch mit einem hohen Druck gepresst und auf Grund der
hohen Dichte der Packung in sehr kurzer Zeit aufgetrennt.
Die Grösse eines Proteins wird normalerweise mit dem sogenannten
SDS-PAGE, einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Bei
diesem Verfahren werden die Proteine zunächst mit einer reduzierenden
Substanz behandelt, die die S-S-Brücken und damit die Untereinheiten
trennt, und dann mit einem Detergenz (SDS)
behandelt, dass an die hydrophoben Bereiche bindet und die Proteine so
mit einer negativen Ladung versieht. Diese Proteine werden an dem Gel
aufgetragen und bewegen sich auf Grund ihrer Ladung in Richtung einer
positiven Elektrode.
Die nach ihrer Grösse aufgetrennten Proteine können gefärbt und dann
auswegertet werden.
Bei dieser Methode können sich allerdings Banden überlagern und die
Genauigkeit ist nicht sonderlich hoch. Benutzt man jedoch ein
zweidimensionales Verfahren, das die Proteine auf Grund ihrer Ladung
und ihrer Grösse trennt, erreicht man wesentlich besssere Resultate.
Hierbei werden die Proteine zunächst entsprechend ihrem
isoelektrischen Punktes aufgetrennt und dann in einem zweiten Schritt
entlang einer senkrecht zur bisherigen Ebene verlaufenden
Trennungsebene aufgetrennt. So erhält man eine zweidimensionale
Proteinkarte.
Um in einem Gel ein bestimmtes Protein nachzuweisen, verwendet man das
Western-Blotting. Hierbei wird ein Gel mittels eine elektrischen Felds
auf einer Cellulosemembran aufgebracht. Auf dieser kann man das
Protein mit einem spezifischen Antikörper nachweisen.
Schneidet man ein Protein mit sequenzspezifischen Peptidasen, so
erhält man eine Mischung von kleinen Peptidfragmenten, die man mittels
Chromatorgrafie zu einer Peptidkarte trennen kann. Mittels solcher
Karten kann man zum Beispiel defekte Proteine (Sichelzellenanämie)
identifizieren.
Die genaue Squenz kann man mit einem automatischen Verfahren durch
sequentielles Abspalten der einzelnen Aminosäuren analysiert
werden. Aus diesen Informationen kann man dann eine DNA-Sonde
herstellen, mit der man dann die DNA-Sequenz ,,fischen``
kann.
Um die dreidimensionale Struktur eines Proteins vorherzusagen benötigt
man die Röntgen-Kristallstrukturanalyse. Lenkt man einen
konzentrierten Röntgenstrahl auf eine reine, kristallisierte Probe
eines Proteins, so werden die meisten Strahlen die Probe passieren;
einige werden jedoch gestreut und können auf einem Detektor als
Beugungmuster sichtbar gemacht werden.
Eine andere Methode ist die Kernresonanzspektroskopie (NMR). Bei
diesem Verfahren benötigt man keine kristalline Probe, sondern nur
eine konzentrierte Lösung des Proteins.
Das Verfahren beruht darauf, dass man den Spin eines Atoms mit einem
starken Magnetfeld ausrichtet; wenn er dann wieder in seinen
Grundzustand zurückkehrt, emmitiert er eine messbare Radiostrahlung.
Bei der zweidimensionalen NMR misst man die charakteristische Frequenz
und Intensität der Wasserstoffe eines Aminosäurerestes und dessen
Beeinflussung durch andere Gruppen. So kann man eine dreidimensionale
Verteilung der Aminosäuren rekonstruiern.
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