Unterabschnitte
Isolieren von Genen
Restriktionskarten und RFLP
Das Verfahren, genetische Kopplungskarten von Mutationen zu erstellen
ist bei den neideren Eukaryoten und den Prokaryoten zwar noch
durchführtbar, bei höheren Eukaryonten allerdings nicht mehr, da die
Reproduktionstrate der meisten Tiere zu niedirig ist.
Aus diesem Grund verwendet man für das Erstellen von Kopplungskarten
heute zumeist Restriktionskarten. Eine Restriktionskarte verwendet man
zwei oder mehrere Restriktionsendonukleasen, die einzeln und zusammen
eine DNA verdauen. Aus den daraus folgenden Schnittmustern kann man
die Lage der Restriktionsschnittstellen in Relation zueinander
bestimmen. Es ist nützlich, wenn man über eine Endmarkierung das
Endstück der DNA radioaktiv markiert und dieses so in dem Gel direkt
identifizieren kann.
Damit man eine solche Restriktionkarte mit einer genetischen Karte
vergleichen kann, müssen die Restriktionsschnittstellen von einem
Wildtyp und einer Mutante verglichen werden.
Bei einem Restriktionsfragementlängenpolymorphismus wird nur der
Genotyp betrachtet und auf die Kopplung zwischen einer Mutation und
einer veränderten Schnittstelle hin untersucht.
Wenn z.B. ein Restriktionsmarker so dicht neben einer Mutation liegt,
dass diese immer gekoppelt vererbt werden, kann dieser Marker zu einer
einfachen Diagnose mittels RFLP genutzt werden; ausserdem kann die
Lokalisation eines gekoppelt vererbten Markers ein erster Schritt in
Richtung auf eine Isolation des Genes bedeuten.
Der RFLP kann auch zu einem Vaterschaftstest verwendet werden, indem
ein geeigneter Abschnitt der DNA mittels einem RFLP verglichen
wird. Dies nennt man dann DNA-Fingerabdruck.
Hierbei weist man einem neuen RFLP an Hand eines Lod-Wertes, der
angeibt, wie wahrscheinlich das Zustandekommen der Daten bei einer
Kopplung wäre, einer Kopplungsgruppe zu und kann ihm - über die
Kopplungsgruppe - auch einen Platz innerhalb der genetischen Karte
zuweisen.
DNA-Sequenzierung
Bei der Sequenzierung unterscheidet man eine chemische von einer
enzymatischen Methode.
Bei der chemischen Methode verwendet man die oben genannten radioaktiv
markierten Fragmente und behandelt sie in vier verschiednen Ansätzen
mit einem Reagenz, dass jeweils bei einer der vier Basen den Strang
zufällig spaltet.
Trägt man dann diese Fragmente auf einem Gel auf, so erhält man
chakteristische Banden für jede Base. Dieses Gel kann man entgegen der
Laufrichung lesen - dies ergibt die Basensequenz.
Bei der enzymatischen Methode wird die DNA mittels der Polymerase
vervielfältigt. Dabei befindet sich neben den normalen den normalen
Nukleotiden ein Überschuss an Didesoxy-Nukleodid einer Base in der
Lösung. Diese kann zwar in die DNA eingebaut werden, allerdings können
keine weiteren Nukleotide angehängt werden.
Dadurch entstehen wiederunm Fragmente einer charakteristischen Länge
für jede Base. Diese Fragmente lassen sich in einem Gel
kontrollieren.
Relation zwischen DNA und Protein
Bei Bakterien und Viren sind die Gene zu den Proteinen colinear,
d.h. dass die Nukleotidsequenz genau der Aminosäuresequenz
entspricht. Bei den Eukaryonten ist die Identifikation auf Grund der
Instrons schwieriger. Ausserdem kann auch nicht das Gen direkt sondern
eines der an der Regulation beteiligten Proteine mutiert sein.
Mutationen in den Bereichen der Introns können das Spleissen
beeinflussen.
Des weiteren findet man in einigen Fällen auch überlappende Gene, bei
denen z.B. ein Genabschnitt dazu verwendet wird, entweder ein
eigenständiges Protein oder aber die Untereinheit eines anderen
Proteins zu kodieren. Bei einigen Genen von Viren und Mitochondiren
gibt es zusätzlich auch innerhalb eines Gens unterschiedliche
Leseraster, die alle ein funktionales Protein synthetisieren können.
Eine weiteres Erschwernis ist der Fall wenn sich mehrere Exons
unterschielich Kombinieren können wie die etwa im Immunsystem der Fall
ist.
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